18.10.2017: Как это осуществляется в "Бетагран - Липецк".
 |
Дмитрий Машталер
старший эмбриолог ООО "Бетагран- Липецк"
В течении последнего времени в России уделяется существенное внимание вопросам в области воспроизводства стада и повышения уровня племенных качеств животных, так как это является краеугольным камнем в отечественном животноводстве. Однако успешное решение данных вопросов невозможно без использования современных методов и технологий, которые уже давно нашли свое применение в странах Запада.
Получение эмбрионов крупного рогатого скота методом in vitro - современный и прогрессивный биотехнологический метод, позволяющий значительно ускорить процесс воспроизводства высокопродуктивных животных. Данный метод состоит из нескольких этапов: извлечение ооцитов из антральных фолликулов яичника (OPU), созревания ооцитов (IVM - in vitro maturation); оплодотворения (IVF - in vitro fertilization) и эмбриональной культуры (IVC - in vitro culture). Важным аспектом данной технологии является то, что получать яйцеклетки от животных доноров можно как прижизненно, используя метод трансвагинальной аспирации, так и от убойного материала (яичники коров с мясокомбината). Получение разделённых по полу эмбрионов - востребованный и перспективный метод, который заключается в оплодотворении яйцеклеток сексированной спермой быков. Оплодотворение яйцеклеток разделённой по полу спермой в отличие от обычной даёт возможность получать особей желательного пола с вероятностью до 93 %. Помимо возможностей в области селекции данный метод имеет и ряд экономических преимуществ, а именно: при пересадке эмбрионов, не разделённых по полу, частота рождения бычков составляет до 55%. Что имеет немаловажное значение в молочном скотоводстве, где есть большая потребность в ремонтных тёлочках с высокой молочной продуктивностью.
Исходя из этого перед коллективом лаборатории ООО «Бетагран- Липецк» была поставлена задача направленная на создание оптимального протокола оплодотворения и культивирования доимплантированных эмбрионов in vitro. Для этого ооциткумулюсные комплексы получали прижизненно из антарльных фолликулов диаметром 2-6 мм от коров доноров методом TAU (транс вагинальной аспирации. После чего ооциткумулюсные комплексы помещались в среду дюльбекко с добавлением с 5% эстральной сыворотки, 4% р-ра гентамицина и р-ра. гепарина. Поиск и морфологическую оценку осуществляли на стереомикроскопе лабораторного класса, Olympus SZ51 при 200 кратном увеличении. Для экспериментов отбирали ооциты средней величины с мелкозернистой ооплазмой, окруженные компактным многослойным кумулюсом. Для дозревания ооцитов использовали среду 199 (Medium 199, Hepes modification, 25mM.) с добавлением 10% эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота, Na-пирувата, BSA, 1.0 ЕД / мл лютенизирующего гормона, 10 ME/мл, фолликулостимулирующего гормона, 1,0мкг / мл эстрадиола (спиртовой раствор) и 50 мкг / мл гентамицина.
Ооциты помещали в лунки планшетов в среду созревания в объёмом 500 мкл под минеральным маслом ("Sigma", США) и культивировали в течение 20-24 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере 5 % CO2 в воздухе. Для оплодотворения использовали разделённое по полу криоконсервированное семя быков в пайэтах объёмом 0,25 мл из расчёта 1 доза на 30 яйцеклеток. Оттаивание производили при температуре + 37 º С в течении 40 секунд. По той же схеме оттаивалось и обычное семя быков. Получение подвижной фракции сперматозоидов проводили путём центрифугирования в градиенте плотности (р-р перколла) при оборотах ротора центрифуги 300G. Выход подвижных сперматозоидов при центрифугировании в градиенте плотности был больше, чем при использовании метода флотации (Swim Up). Для оплодотворения яйцеклетки перемещались в лунки со средой Fert-TALP объёмом 80 мкл. И инкубировались совместно со сперматозоидами в течении 18-20 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере с содержанием 5 % CO2.
После оплодотворения зиготы отмывали в растворе SOF и механически удаляли клетки кумулюса посредством пепетирования при помощи наконечников для денудации ооцитов диаметром 135 мкм. Очищенные зиготы помещались в среду на основе SOF c добавлением BSA, MEM vitamins, MEM Niaa, MEM iaa в лунки планшетов объёмом 500 мкл, покрытые минеральным маслом ( Sigma ,США) и культивировали при температуре 38,5º С в увлажненной атмосфере под газовой фазой (по 5% CO2 и O 2 и 90 % N2) в течение 7-8 суток. Количество оплодотворённых зигот подсчитывали через 48 и 62 часа после оплодотворения.
Для определения эффективности оплодотворения сексированной спермы использовалось заморожено-оттаянное семя пяти быков. Было оплодотворено 1050 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 944 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 89,93%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 29,42%
Таблица 1 Оплодотворяемость и выход эмбрионов сексированное семя
|
№п/п |
Бык |
∑ опл. окк |
∑ дроб. |
% от дроб |
Выход бластоцист |
% от опл. |
% от дроб. |
|
|
1 |
Маузер |
346 |
321 |
93,00% |
94 |
29,28% |
27,16% |
|
|
2 |
Мосби |
358 |
322 |
90,60% |
96 |
29,81% |
26,81% |
|
|
3 |
Коди |
121 |
107 |
88,45% |
50 |
46,72,% |
41,32% |
|
|
4 |
Бигшот |
92 |
88 |
90,88% |
32 |
36,36% |
34,78% |
|
|
5 |
Инспект |
117 |
106 |
91,55% |
37 |
34,90% |
34,90% |
|
|
итого |
1050 |
944 |
89,93% |
309 |
32,73% |
29,42% |
||
Во втором случае использовалось обычное заморожено-оттаянное семя от четырёх быков. Было оплодотворено 770 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 708 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 91,94%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 35,58%.
Таблица 2 Оплодотворяемость и выход эмбрионов обычное семя
|
№п/п |
Вид семени |
∑ опл. окк |
∑ дроб |
% от дроб |
Выход бластоцист |
% от опл. |
% от дроб |
|
1 |
Обычное |
770 |
708 |
91,94% |
274 |
38,70% |
35,58% |
|
2 |
сексированное |
1050 |
944 |
89,93% |
309 |
32,73% |
29,42% |
Таким образом сравнивая вышеперечисленные данные, можно сделать вывод, что
оплодотворяющая способность сексированного и традиционного семени не имеет
значительных расхождений.
Таблица 3 Сравнительная характеристика и эффективность использования
сексированного и традиционного семени при производстве эмбрионов in
vitro.
Так разница составила 2,01% в пользу обычного семени.
Выход эмбрионов был больше на 6,16 в пользу обычного семени. Несмотря на то,
что культивирование эмбрионов производилось на одной культуральной системе,
количество полученных эмбрионов in vitro было выше в группе, где использовалось
обычное семя. Мы предполагаем, что это связанно с окрашиванием сперматозоидов
флуоресцентной краской, из-за чего снижается энергетический запас, что и может
обуславливать меньший жизненный потенциал гамет по сравнению с обычным
семенем, как следствие - остановку развития некоторых эмбрионов.
Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что разработанный протокол оплодотворения и культуральная система обладает высоким потенциалом и позволяет получать в массовом количестве разделённые по полу эмбрионы по технологии in vitro. А также может использоваться для получения зигот и предимплантационных эмбрионов КРС in vitro для различных биотехнологических программ.
Статья взята с сайта © DairyNews.ru http://www.dairynews.ru/news/effektivnost-polucheniya-seksirovannykh-embrionov-.html
18.10.2017 0
На Дне виноградника, организованном компанией «Щёлково Агрохим» в Республике Крым, Наталья Алейникова – заместитель директора по научной работе ФГБУН «ВННИИВиВ «Магарач», главный научный сотрудник лаборатории защиты растений, д. с.-х. н. – дала оценку фитосанитарного состояния виноградных насаждений в текущем сезоне.
«И опыт, сын ошибок трудных...»
Цитируя классика мировой литературы Александра Сергеевича Пушкина, Наталья Васильевна снова напомнила, что каждый год агроном переживает новую жизнь. И в этом году она была особенно сложной.
Сначала она озвучила среднемесячные температуры воздуха и количество осадков вегетационного периода 2023 года. Согласно данным метеостанции в Севастополе, было зафиксировано максимальное количество осадков в виде ливней: май – 75 мм, июнь – 90 мм, июль – 80 мм. Это в несколько раз превышало среднемноголетние данные, уточнила Наталья Алейникова.
Все особенности развития вредных организмов на виноградниках Крыма в 2023 году, прежде всего, обусловлены погодными условиями:
-
устойчивым переходом через 10 °C в 1-2 декаде апреля;
-
умеренными температурами воздуха и повышенной влажностью в мае и июне;
-
осадками в виде ливней и града в мае, июне и июле;
-
резкими колебаниями среднесуточных температур воздуха от умеренных до повышенных в июле;
-
обильным выпадением рос.
Затем Наталья Васильевна рассказала об основных болезнях и вредителях винограда в условиях полуострова. Среди болезней винограда одной из наиболее вредоносных на виноградниках Крыма является оидиум. В 2023 году благоприятные условия для первичной инфекции сложились как для половой, так и бесполой стадии развития патогена. Заражение аскоспорами из перезимовавших клейстотециев наблюдали в 2-й и 3-й декаде апреля, что обусловлено осадками более 2-3 мм при температуре выше 10 °C, конидиями – появление «флаговых побегов» – в 1-й декаде мая, т. е. в этом году благоприятные условия складывались гораздо раньше.
Визуальные признаки проявления вторичной инфекции оидиума (контроль – на фоне естественного развития)
Хлоротичные пятна на листьях отмечали в 2-й декаде мая
Развитие мицелия и спороношение патогена оидиума на соцветиях зафиксировали 30 мая
Нарастание интенсивности развития оидиума на листьях и гроздях растений винограда и переход его в эпифитотию отмечали в 2-й и 3-й декаде июня
Грозди винограда, полностью поражённые оидиумом (6 июля)
Основным фактором, ограничивающим развитие оидиума, является температура, напомнила Наталья Васильевна. Как только происходит первоначальное заражение, оптимальная температура для развития патогена составляет 21-29,4 °C. Температура выше 35 °C в течение более чем 12 часов приводит к замедлению роста микромицета. Благоприятной для развития патогена является относительная влажность воздуха в 85%.
Начиная с мая и весь июнь отмечали высокий индекс риска развития оидиума. Он рассчитан по модели калифорнийских учёных, базирующейся на значениях температуры воздуха, который составил 60-100 баллов. Относительная влажность воздуха в этот же период также была оптимальной для развития патогена. Таким образом, в течение всего сезона был практически 100-процентный риск заражения и развития этого патогена.
Наталья Алейникова:
«В условиях такого высокого риска заражения проведение химических обработок рекомендуется каждые 7-10 дней! Иначе с болезнью не справиться»
В условиях обильных осадков прекрасно вегетируют растения винограда, а вместе с ними и сорняки: они создают ещё более благоприятные условия для развития вредных организмов и снижают эффективность химических опрыскиваний. К 24 июля на контрольном варианте было зафиксировано 100-процентное заражение гроздей.
Другой, не менее вредоносной болезнью на винограде является милдью. Благоприятные условия для неё возникают при наличии капельно-жидкой влаги.
В этом году первичное заражение (от почвы до виноградного растения) фиксировали 29 мая – 1 июня. В это время сложились благоприятные условия: осадки более 10 мм и температура воздуха выше 10 °C в течение 24-часового периода.
Спороношение милдью с обратной стороны «маслянистого» пятна отмечали 12 июня, что означает конец инкубационного периода
Вторичная инфекция – от листа к листу, соцветию, ягодам. Первые случаи спороношения на единичных «маслянистых» пятнах наблюдали начиная с 13 июня.
Такого раннего проявления болезни, развитие которой в нынешнем году проходило по типу ранней эпифитотии, не наблюдалось последние 20 лет. Обычно благоприятные условия складывались в 2-й и 3-й декаде июня.
Поражение соцветий и гроздей милдью отмечали начиная с 16 июня
21 июля 3 августа
Наталья Алейникова:
«Многие агрономы путают солнечные ожоги и проявление недостаточного минерального питания в первой половине вегетации на листьях с проявлением милдью. Также солнечные ожоги на гроздях путают с проявлением болезни. Хочу пояснить, что данный патоген внедряется в ягоду через гребненожку и большую часть своего развития проходит внутри. Когда мы видим визуальное его проявление на ягодах (сморщивание, усыхание), реанимировать гроздь уже бесполезно!»
– Где раньше проявляется поражение милдью: на ягодах или листьях?
– По срокам милдью раньше проявляется на молодых соцветиях и гроздях, но мы просто этого не увидим. А вот «маслянистое» пятно на листьях, особенно если там есть спороношение, – это отличительный симптом данной болезни, и его сложно с чем-то спутать.
Какие же особенности и благоприятные условия для развития милдью имелись в этом году? В первую очередь это наличие капельно-жидкой влаги, температура воздуха 20-25 °C и относительная влажность не менее 90% в ночные часы. Они сохранялись в течение июня и первой половины июля. Количество инфекции милдью увеличивалось в геометрической прогрессии. За сезон милдью может давать 15-16 генераций при благоприятных условиях.
На отдельных участках винограда интенсивность поражения листьев и гроздей достигала 50-80%
Основным вредителем на виноградниках Крыма является гроздевая листовёртка. Наталья Васильевна прокомментировала сезонную динамику лёта бабочек и плотность популяций вредителя по данным феромонного мониторинга.
Так, на виноградниках Западного предгорно-приморского района Крыма в 2023 году условия для спаривания и яйцекладки гроздевой листовёртки сложились только с 12-13 мая, когда сумеречные температуры воздуха достигли температуры выше 15 °C, а соцветия растений винограда достаточно развились: туда вредителю можно было отложить яйца. Массовое отрождение гусениц I генерации наблюдали с 22-25 мая по 2-ю декаду июня, т. е. не менее трёх недель.
На фоне благоприятной влажности воздуха (в пределах 50-97%) и умеренных температур воздуха отмечали высокую численность отродившихся гусениц листовёртки: до 30-36 гусениц на 100 гроздей, что практически в три раза превышало экономический порог вредоносности (ЭПВ). Естественно, в таких условиях потребовалось проведение 2-3 инсектицидных обработок для защиты винограда от данного вредителя.
Начало массового лёта бабочек гроздевой листовёртки II генерации зафиксировали 23-27 июня (кроме ЮБК), который со снижениями интенсивности продолжался до 10-17 июля, в отдельных хозяйствах – до 23-24 июля. При существенно меньшей (в 2-14 раз) интенсивности лёта бабочек II генерации (относительно I генерации) продолжительность периода отрождения гусениц составила 3-4 недели, что также потребовало проведения двух инсектицидных обработок. В настоящий момент на виноградниках ещё можно обнаружить гусениц листовёртки старших возрастов, которые заканчивают своё развитие.
В условиях ЮБК отмечали стабильно непрерывный лёт бабочек с отдельными пиками численности незначительно выше ЭПВ.
Исходя из накопленной суммы эффективных температур воздуха в 1-й декаде августа, можно ожидать начало лёта бабочек III генерации гроздевой листовёртки.
Питание садового паутинного клеща (Schizotetranychus pruni Oudms) на нижних листьях и начало яйцекладки наблюдали в 2-й декаде мая на виноградниках, заселённых вредителем в предыдущие годы.
В 3-й декаде мая в очагах развития данного вида паутинного клеща заселённость достигала 10-54 особей и 10-25 яиц на лист; в 2-й декаде июля – 26-73 особи и 18-26 яиц.
На отдельных участках в июле фиксировали присутствие обыкновенного паутинного клеща (Tetranychus urticae Koch.) в низкой численности.
На виноградниках без специализированных акарицидных обработок фиксировали высокую интенсивность галлообразования виноградного войлочного клеща Colomerus (Eriophyes) vitis Pgst. и отмечали две «волны» его расселения на верхнем ярусе листьев: в 1-2 декадах мая на первых 5-7 листьях, в 2-3 декадах июня.
Развитие виноградного галлового клеща (26.07)
Инвазивные виды цикадок
Первые признаки повреждения листьев винограда цикадкой японской виноградной (Arboridia kakogawana) отмечали в 2-й декаде мая. В периоды развития личинок I и II генераций на отдельных участках фиксировали заселённость до 5-7 нимф на лист. При такой численности вредителя рекомендуется проведение инсектицидной обработки для предупреждения интенсивного роста популяции в августе-сентябре.
В этом году в условиях Западного предгорно-приморского района 25 мая зафиксирован первый случай обнаружения на виноградниках Крыма личинки и имаго многоядного сосущего вредителя цикадки белой (Metcalfa pruinosa). Подобные симптомы развития данного вида цикадки были выявлены в июне и на винограднике на ЮБК. Таким образом, можно сделать вывод об инвазии меткальфы на виноградники Крыма.
Наталья Алейникова:
«Краснодарские коллеги уже давно говорят об инвазии данного вида цикадки на винограднике. Но мы впервые услышали о цикадке белой от одесских коллег. Вредителя развелось столько, что в городе было невозможно ходить по асфальту: обувь прилипала из-за его липких выделений».
На гребне соцветия в белых ватообразных восковых выделениях – питающиеся личинки младшего возраста цикадки белой
Бабочка хлопковой совки
Хлопковую совку (Helicoverpa armigera) на виноградниках Крыма наблюдают уже последние 10 лет. В период развития I генерации вредителя фиксировали единичных бабочек. Гусениц совки и повреждений ими листьев или гроздей не отмечали. Со второй половины июля зафиксирована яйцекладка вредителя II генерации на гроздях винограда. Повреждения пока в слабой степени.
Ещё один инвазивный вредитель виноградников – это коричнево-мраморный клоп (Halyomorpha halys Stål), который из Абхазии через Краснодар пришёл к нам в Крым.
С 3-й декады июня отмечено присутствие перезимовавших имаго карантинного вредителя – коричнево-мраморного клопа. В 1-й декаде июня зафиксированы первые личинки клопа 1-2 возрастов I генерации.
После некоторого спада численности клопа в 2022 году в августе-сентябре этого года на виноградниках ожидается существенный рост популяции данного вредителя, о чём свидетельствуют результаты мониторинга клопа с помощью феромонных ловушек.
Особенности поведения: скученность, отсутствие потребности питаться личинок 1-го возраста; метаморфозы при переходе личинок клопа из 1-го возраста в 2-й; линька и изменение окраски тела от оранжевого к чёрному.
Имаго клопа (03.07.)
Линька личинок 1-го возраста (28.07.)
Случаи развития чёрной гнили (Macrophoma flaccida [Viala et Rav.] Cav.) на единичных ягодах отмечали в 2-й декаде июля после повышения температуры воздуха в 1-й декаде июля.
Развитие серой гнили (Botrytis cinerea Pers.) было сопряжено с осадками: первые случаи поражения растущих ягод винограда сортов с плотной гроздью (Бастардо), отмечали в 3-й декаде июля, после дождей в 2-й декаде июля.
Более подробно Наталья Алейникова остановилась на системных заболеваниях многолетней древесины, которые в последнее время всё чаще проявляются на крымских виноградниках.
В частности, отмечается поражение проводящей системы виноградных растений комплексами грибов, вызывающих заболевания – эска, эутипиоз, эскориоз (сухорукавность), ботриосферное отмирание, корневая гниль «чёрная ножка винограда», – в условиях стресса, обусловленного резкими колебаниями температур воздуха и увлажнением в период вегетации.
Эутипиоз
Возбудители Eutypa lata, Eutypella vitis, Eutypella microtheca, Eutypella citricola и Diatrypella vulgaris. Аскоспоры выделяются в течение всего года, их высвобождение начинается через 2-3 часа после начала дождя и прекращается через 24 часа после его прекращения. Аскоспоры проникают в растение через раны после обрезки в период зимнего покоя.
Симптомы характеризуются чахлыми побегами с укороченными междоузлиями и мелкими, хлоротичными, чашевидными и рваными листьями с краевым некрозом и мёртвой межжилковой тканью, что вызвано в том числе присутствием токсинов Eutypa. После инфицирования в результате обрезки и колонизации сосудистых тканей многолетней древесины обычно развивается коричневый клиновидный некроз.
Проявление признаков поражения виноградных растений эутипиозом на виноградниках Крыма наблюдали начиная с 2-й декады мая. Развивающиеся побеги отставали в росте, листья были мелкие, иногда чашечковидной формы.
Ботриосферное отмирание
Из 22 видов возбудителей наиболее распространены три: Diplodia seriata, Neofusicoccum luteum, Dothiorella viticola, Botryosphaeria dothidea. Пикниды развиваются на заражённой древесине. Воздушный инокулят присутствует, особенно во время дождя. Распространение спор может происходить и без дождя. Основным признаком заболевания является наличие на поперечном срезе многолетних частей виноградного куста клиновидной язвы, аналогичной как таковой у Eutypa lata.
В весенний период наблюдались неравномерное распускание почек и рост побегов. Развивающиеся на побегах листья, характеризовались наличием хлоротичности, деформации и некрозов. С мая по июнь на краях листьев наблюдали появление желтовато-оранжевых (белые сорта) или тёмно-красных (красные сорта) пятен. По мере прогрессирования заболевания эти пятна сливаются, образуя крупные межжилковые некрозы. В июле фиксировали отмирание одного или нескольких побегов, целых рукавов, кустов, опадение листьев, сморщивание и засыхание гроздей.
Эска
Основные возбудители эски: из аскомицетов – Phaeomoniella chlamydospora и Phaeoacremonium aleophilum; из базидиомицетов – Fomitipiria mediterrania. Поперечные срезы многолетних частей виноградного куста обычно имеют мягкую гниль от белого до жёлтого цвета.
Проявление внешних признаков эски (появление на листьях пятен между жилками, которые расширяются и сливаются, что в конечном итоге приводит к образованию хлоротичных и некротических участков с узкой зелёной полосой вдоль средней жилки) фиксировали начиная с 1-й декады июля.
Также наблюдали такое явление, как апоплексия – отмирание куста полностью, одного или нескольких побегов, опадение листьев, сморщивание и засыхание гроздей.
Первые признаки фитоплазменного заболевания почернение древесины винограда (Candidatus Phytoplasma solani) отмечали в 3-й декаде мая (сорт Шардоне). В период цветения винограда наблюдали усыхание и осыпание частей соцветий в результате поражения данным фитоплазмозом. Типичные симптомы (скручивание листьев, усыхание ягод и т. д.) встречались с 2-й декады июня.
Поражение растений винограда возбудителем чёрной пятнистости (это тоже системное заболевание) наблюдали после осадков 28-29 апреля, 1 и 9 мая. Повсеместное проявление симптомов заболевания на листьях нижнего яруса, первых междоузлиях побегов отмечали в 2-й декаде мая. Последующие дожди способствовали распространению инфекции.
Контроль
Данные заболевания носят системный характер, то есть возбудители забивают проводящую систему, накапливаются в ней. Понятно, что истребительных мер контроля не существует. Все меры – выкорчёвка и обрезка поражённых рукавов – носят предупредительный характер. Участки виноградников, на которых распространены системные заболевания, нужно обрезать в последнюю очередь и не забывать дезинфицировать инструменты (секатор, пилки), чтобы не распространять инфекцию во время обрезки на здоровые растения, рекомендует Наталья Алейникова.