18.10.2017: Как это осуществляется в "Бетагран - Липецк".
 |
Дмитрий Машталер
старший эмбриолог ООО "Бетагран- Липецк"
В течении последнего времени в России уделяется существенное внимание вопросам в области воспроизводства стада и повышения уровня племенных качеств животных, так как это является краеугольным камнем в отечественном животноводстве. Однако успешное решение данных вопросов невозможно без использования современных методов и технологий, которые уже давно нашли свое применение в странах Запада.
Получение эмбрионов крупного рогатого скота методом in vitro - современный и прогрессивный биотехнологический метод, позволяющий значительно ускорить процесс воспроизводства высокопродуктивных животных. Данный метод состоит из нескольких этапов: извлечение ооцитов из антральных фолликулов яичника (OPU), созревания ооцитов (IVM - in vitro maturation); оплодотворения (IVF - in vitro fertilization) и эмбриональной культуры (IVC - in vitro culture). Важным аспектом данной технологии является то, что получать яйцеклетки от животных доноров можно как прижизненно, используя метод трансвагинальной аспирации, так и от убойного материала (яичники коров с мясокомбината). Получение разделённых по полу эмбрионов - востребованный и перспективный метод, который заключается в оплодотворении яйцеклеток сексированной спермой быков. Оплодотворение яйцеклеток разделённой по полу спермой в отличие от обычной даёт возможность получать особей желательного пола с вероятностью до 93 %. Помимо возможностей в области селекции данный метод имеет и ряд экономических преимуществ, а именно: при пересадке эмбрионов, не разделённых по полу, частота рождения бычков составляет до 55%. Что имеет немаловажное значение в молочном скотоводстве, где есть большая потребность в ремонтных тёлочках с высокой молочной продуктивностью.
Исходя из этого перед коллективом лаборатории ООО «Бетагран- Липецк» была поставлена задача направленная на создание оптимального протокола оплодотворения и культивирования доимплантированных эмбрионов in vitro. Для этого ооциткумулюсные комплексы получали прижизненно из антарльных фолликулов диаметром 2-6 мм от коров доноров методом TAU (транс вагинальной аспирации. После чего ооциткумулюсные комплексы помещались в среду дюльбекко с добавлением с 5% эстральной сыворотки, 4% р-ра гентамицина и р-ра. гепарина. Поиск и морфологическую оценку осуществляли на стереомикроскопе лабораторного класса, Olympus SZ51 при 200 кратном увеличении. Для экспериментов отбирали ооциты средней величины с мелкозернистой ооплазмой, окруженные компактным многослойным кумулюсом. Для дозревания ооцитов использовали среду 199 (Medium 199, Hepes modification, 25mM.) с добавлением 10% эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота, Na-пирувата, BSA, 1.0 ЕД / мл лютенизирующего гормона, 10 ME/мл, фолликулостимулирующего гормона, 1,0мкг / мл эстрадиола (спиртовой раствор) и 50 мкг / мл гентамицина.
Ооциты помещали в лунки планшетов в среду созревания в объёмом 500 мкл под минеральным маслом ("Sigma", США) и культивировали в течение 20-24 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере 5 % CO2 в воздухе. Для оплодотворения использовали разделённое по полу криоконсервированное семя быков в пайэтах объёмом 0,25 мл из расчёта 1 доза на 30 яйцеклеток. Оттаивание производили при температуре + 37 º С в течении 40 секунд. По той же схеме оттаивалось и обычное семя быков. Получение подвижной фракции сперматозоидов проводили путём центрифугирования в градиенте плотности (р-р перколла) при оборотах ротора центрифуги 300G. Выход подвижных сперматозоидов при центрифугировании в градиенте плотности был больше, чем при использовании метода флотации (Swim Up). Для оплодотворения яйцеклетки перемещались в лунки со средой Fert-TALP объёмом 80 мкл. И инкубировались совместно со сперматозоидами в течении 18-20 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере с содержанием 5 % CO2.
После оплодотворения зиготы отмывали в растворе SOF и механически удаляли клетки кумулюса посредством пепетирования при помощи наконечников для денудации ооцитов диаметром 135 мкм. Очищенные зиготы помещались в среду на основе SOF c добавлением BSA, MEM vitamins, MEM Niaa, MEM iaa в лунки планшетов объёмом 500 мкл, покрытые минеральным маслом ( Sigma ,США) и культивировали при температуре 38,5º С в увлажненной атмосфере под газовой фазой (по 5% CO2 и O 2 и 90 % N2) в течение 7-8 суток. Количество оплодотворённых зигот подсчитывали через 48 и 62 часа после оплодотворения.
Для определения эффективности оплодотворения сексированной спермы использовалось заморожено-оттаянное семя пяти быков. Было оплодотворено 1050 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 944 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 89,93%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 29,42%
Таблица 1 Оплодотворяемость и выход эмбрионов сексированное семя
|
№п/п |
Бык |
∑ опл. окк |
∑ дроб. |
% от дроб |
Выход бластоцист |
% от опл. |
% от дроб. |
|
|
1 |
Маузер |
346 |
321 |
93,00% |
94 |
29,28% |
27,16% |
|
|
2 |
Мосби |
358 |
322 |
90,60% |
96 |
29,81% |
26,81% |
|
|
3 |
Коди |
121 |
107 |
88,45% |
50 |
46,72,% |
41,32% |
|
|
4 |
Бигшот |
92 |
88 |
90,88% |
32 |
36,36% |
34,78% |
|
|
5 |
Инспект |
117 |
106 |
91,55% |
37 |
34,90% |
34,90% |
|
|
итого |
1050 |
944 |
89,93% |
309 |
32,73% |
29,42% |
||
Во втором случае использовалось обычное заморожено-оттаянное семя от четырёх быков. Было оплодотворено 770 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 708 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 91,94%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 35,58%.
Таблица 2 Оплодотворяемость и выход эмбрионов обычное семя
|
№п/п |
Вид семени |
∑ опл. окк |
∑ дроб |
% от дроб |
Выход бластоцист |
% от опл. |
% от дроб |
|
1 |
Обычное |
770 |
708 |
91,94% |
274 |
38,70% |
35,58% |
|
2 |
сексированное |
1050 |
944 |
89,93% |
309 |
32,73% |
29,42% |
Таким образом сравнивая вышеперечисленные данные, можно сделать вывод, что
оплодотворяющая способность сексированного и традиционного семени не имеет
значительных расхождений.
Таблица 3 Сравнительная характеристика и эффективность использования
сексированного и традиционного семени при производстве эмбрионов in
vitro.
Так разница составила 2,01% в пользу обычного семени.
Выход эмбрионов был больше на 6,16 в пользу обычного семени. Несмотря на то,
что культивирование эмбрионов производилось на одной культуральной системе,
количество полученных эмбрионов in vitro было выше в группе, где использовалось
обычное семя. Мы предполагаем, что это связанно с окрашиванием сперматозоидов
флуоресцентной краской, из-за чего снижается энергетический запас, что и может
обуславливать меньший жизненный потенциал гамет по сравнению с обычным
семенем, как следствие - остановку развития некоторых эмбрионов.
Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что разработанный протокол оплодотворения и культуральная система обладает высоким потенциалом и позволяет получать в массовом количестве разделённые по полу эмбрионы по технологии in vitro. А также может использоваться для получения зигот и предимплантационных эмбрионов КРС in vitro для различных биотехнологических программ.
Статья взята с сайта © DairyNews.ru http://www.dairynews.ru/news/effektivnost-polucheniya-seksirovannykh-embrionov-.html
18.10.2017 0
К 2030 году производство сельхозпродукции в РФ должно увеличиться на 25% относительно 2021 года, а экспорт продукции АПК – на 50%, примерно до 55,2 млрд долларов. Главный резерв заключается не столько в расширении посевных площадей, сколько в повышении урожайности.
Суверенитет и эффективность
О том, какие технологические решения необходимы для достижения этих показателей, на агрофоруме «Меновой двор» в Оренбурге рассказал генеральный директор АО «Щёлково Агрохим», д. х. н., академик РАН Салис Каракотов. Его выступление «Суверенитет и эффективность: путь АПК к 2030 году», прошедшее в рамках пленарного заседания, было посвящено тому, как связать национальные цели отрасли с конкретными инструментами растениеводства.
В числе культур, за счёт которых предполагается обеспечить рост в АПК, — озимая и яровая пшеница, подсолнечник, соя, рапс и горох.
Академик представил расчёт по озимой пшенице. Средняя урожайность этой культуры в России за последние три года составляет 35-38 ц/га, а к 2030 году её необходимо довести до 46 ц/га. В результате валовой сбор увеличится ещё на 18,8 млн тонн. Для Приволжского федерального округа, куда входит Оренбургская область, ориентир по озимой пшенице – плюс 5 ц/га и дополнительно 3,575 млн тонн зерна. Обеспечить такой прирост можно двумя путями: использованием генетически сильных семян и применение научно обоснованных агротехнологий, неотъемлемая часть которых –защита растений от вредоносных объектов.
В стране засевается около 80 млн га, отметил Салис Каракотов. При этом гербициды и протравители семян используются на всей площади, инсектициды применяются на 94% посевов, а вот фунгицидная защита охватывает только 33,6%. Но именно применение фунгицидов способно сохранить 10–30% урожая. На примере подсолнечника, по площадям которого Оренбургская область занимает второе место в РФ, при средней урожайности культуры 18 ц/га это 1,8–5,4 ц/га. При стоимости тонны 35 тыс. рублей сохранённый урожай даёт 6300–18 900 рублей дополнительной прибыли на гектар. Недобор урожая подсолнечника из-за болезней в масштабе страны оценивается более чем в 76,9 млрд рублей упущенной прибыли.
Примечательно, что российские производители закрывают основную часть спроса на ХСЗР: из 253,1 тыс. т приобретённых средств защиты в 2025 году импортировали около 35 тыс. т. При этом Россия занимает первое место в мире по производству нанопрепаратов.
Питание и защита
Защита сельхозкультур от вредных объектов – только часть технологии. Растение должно получить достаточное количество доступных элементов питания. Об этом на секции «Средства защиты растений, минеральные удобрения: отечественные решения» говорила ведущий научный консультант «Щёлково Агрохим», д. с.-х. н., профессор Галина Петрова. Спикер рассмотрела вопрос питания подсолнечника. Культура активно потребляет NPK: на формирование 100 кг семян расходуется 5–6 кг азота, 2–2,5 кг фосфора и 10–12,5 кг калия.
Проблема недостатка питания особенно актуальна для северной и западной зон Оренбургской области. В 2025 году дефицит NPK с учётом выноса сорной растительности здесь составил 85,49 кг д. в. на гектар: 29,4 кг азота, 9,76 кг фосфора и 46,2 кг калия. При этом около 40% почв имеют pH выше 7,5, из-за чего фосфор и ряд микроэлементов – бор, железо, марганец, медь и цинк – усваиваются растениями хуже.
В таких условиях листовое питание рассматривается не как дополнительная операция, а как инструмент управления урожаем. В ранние фазы подсолнечнику важно сформировать мощную корневую систему. Для этого в схемах «Щёлково Агрохим» используется УЛЬТРАМАГ ФОСФОР СУПЕР, содержащий 539 г/л фосфора, а также магний и цинк. В фазу бутонизации акцент смещается на формирование корзинки, цветение и выполненность семян: здесь применяется УЛЬТРАМАГ БОР с содержанием 150 г/л бора.
Галина Петрова также показала оптимальные схемы защиты гибридов подсолнечника в зависимости от гербицидной технологии. Эксперт рекомендовала включать в обработки новинки ассортимента компании – фунгицид ДЕЙЗИ, СЭ от фомоза, ржавчины, пероноспороза, инсектициды СКУТЕР, МЭ, ПОРФИР, КС против лугового мотылька, хлопковой совки, подсолнечниковой огнёвки.
Именно такая последовательность – защита от сорняков, болезней и вредителей плюс питание в соответствии с фазой развития – была реализована при испытаниях гибридов подсолнечника в ООО «Рокоп» Оренбургской области. В 2025 году на делянках хозяйства испытывали 13 гибридов в сочетании со схемами защиты и листового питания «Щёлково Агрохим». Минимальная урожайность составила 27,3 ц/га у Бомбардира, максимальная – 32,1 ц/га у Базика. Более 30 ц/га также дали Даха, Солнцепёк, Кречет, Ратник, Карина и Искандер.
Для Оренбургской области эти результаты особенно показательны. Средняя урожайность подсолнечника в регионе в 2025 году составила 13,6 ц/га. Таким образом, даже минимальный результат испытаний в «Рокопе» оказался примерно вдвое выше среднеобластного, а максимальный – более чем в 2,3 раза.
От интуиции к управляемому результату
Если задача отрасли – не просто сохранить производство, а системно повышать урожайность, начинать нужно с основы — генетического потенциала культуры. О возможностях отечественных селекционеров говорил на секции «Развитие отечественной селекции и семеноводства» директор департамента селекции и семеноводства «Щёлково Агрохим» Александр Прянишников. Эксперт представил развитие теоретических и методологических основ селекционно-генетических программ компании.
Селекционно-семеноводческая работа ведётся в «Щёлково Агрохим» по ряду культур, в том числе по яровой и озимой пшенице, сое, гороху, рапсу, сахарной свёкле и подсолнечнику. В Госреестре РФ уже находятся семь сортов озимой пшеницы, 15 гибридов подсолнечника, 40 - сахарной свёклы. 12 сортов и гибридов проходят государственные испытания. Селекционно-семеноводческий центр компании располагает собственными площадями для селекции, первичного и оригинального семеноводства.
Развитие селекции в «Щёлково Агрохим» сегодня выходит за рамки создания новых сортов. Компания меняет саму модель селекционной работы: от преимущественно интуитивного поиска перспективных образцов – к интеллектуальной системе, в которой признаки, среда и реакция генотипа анализируются с помощью современных генетических и биотехнологических методов.
Результаты деятельности селекционеров «Щёлково Агрохим» говорят за себя. Озимой пшенице Ермоловке принадлежит рекорд России 146,6 ц/га, Зюгановке - мировой рекорд: 184,95 ц/га. Результат на сое Тейри также занесён в Книгу рекордов России 47,96 ц/га.
В Оренбургской области прекрасно проявляют себя более засухо- и морозоустойчивые сорта озимой пшеницы – Изумруд Дубовицкого и ДФ 2020. В производственном испытании у ИП КФХ Дмитриева В.П. Изумруд Дубовицкого показал 46,3 ц/га против 36,1 ц/га у стандарта. Урожайность ДФ 2020 на полях области составила 29,5 ц/га, тогда как стандарт дал 24,1 ц/га.
При оценке продуктивности новых сортов и гибридов речь идёт не о случайном удачном сочетании погодных условий. «Щёлково Агрохим» формирует для новых сортов технологический паспорт, определяет их реакцию на факторы интенсификации и подбирает технологическую модель возделывания. Такой подход позволяет определить, какую технологию необходимо применить, чтобы реализовать генетический потенциал сорта в конкретном регионе.
Следующий шаг – сделать селекционный процесс более управляемым на уровне генотипа. В сотрудничестве с научными организациями «Щёлково Агрохим» использует ДНК-чипы, генетический анализ и технологию speed breeding. Последняя позволяет формировать за один год селекционные питомники, контролируемо сочетать генетические маркеры, быстрее получать константные растения из гибридных популяций и выделять чистые линии.
Селекционеры осуществляют переход от оценки отдельных признаков к анализу целостного состояния растения. В исследованиях фотосинтетического функционала используются спектральные показатели, связанные с хлорофиллом, водным балансом, фотохимической активностью, содержанием элементов питания и уровнем стресса. На их основе строятся модели, позволяющие связывать измеряемые параметры с продуктивностью и искать признаки, имеющие генетическую основу.
Так формируется новая логика селекции: сначала определить, какие признаки действительно связаны с продуктивностью и устойчивостью, затем найти их генетическую основу, ускорить отбор и после этого проверить результат в конкретной технологии и регионе. В этой системе сорт становится не просто названием в Госреестре, а технологически паспортизированным инструментом производства.
Компания «Щёлково Агрохим» располагает широким набором продуктов и технологий для выполнения стратегических целей развития растениеводства. Работа в данном направлении продолжается, а российские аграрии уже сегодня могут получить доступ к новейшим достижениям науки и практики.