18.10.2017: Как это осуществляется в "Бетагран - Липецк".
|
Дмитрий Машталер
старший эмбриолог ООО "Бетагран- Липецк"
В течении последнего времени в России уделяется существенное внимание вопросам в области воспроизводства стада и повышения уровня племенных качеств животных, так как это является краеугольным камнем в отечественном животноводстве. Однако успешное решение данных вопросов невозможно без использования современных методов и технологий, которые уже давно нашли свое применение в странах Запада.
Получение эмбрионов крупного рогатого скота методом in vitro - современный и прогрессивный биотехнологический метод, позволяющий значительно ускорить процесс воспроизводства высокопродуктивных животных. Данный метод состоит из нескольких этапов: извлечение ооцитов из антральных фолликулов яичника (OPU), созревания ооцитов (IVM - in vitro maturation); оплодотворения (IVF - in vitro fertilization) и эмбриональной культуры (IVC - in vitro culture). Важным аспектом данной технологии является то, что получать яйцеклетки от животных доноров можно как прижизненно, используя метод трансвагинальной аспирации, так и от убойного материала (яичники коров с мясокомбината). Получение разделённых по полу эмбрионов - востребованный и перспективный метод, который заключается в оплодотворении яйцеклеток сексированной спермой быков. Оплодотворение яйцеклеток разделённой по полу спермой в отличие от обычной даёт возможность получать особей желательного пола с вероятностью до 93 %. Помимо возможностей в области селекции данный метод имеет и ряд экономических преимуществ, а именно: при пересадке эмбрионов, не разделённых по полу, частота рождения бычков составляет до 55%. Что имеет немаловажное значение в молочном скотоводстве, где есть большая потребность в ремонтных тёлочках с высокой молочной продуктивностью.
Исходя из этого перед коллективом лаборатории ООО «Бетагран- Липецк» была поставлена задача направленная на создание оптимального протокола оплодотворения и культивирования доимплантированных эмбрионов in vitro. Для этого ооциткумулюсные комплексы получали прижизненно из антарльных фолликулов диаметром 2-6 мм от коров доноров методом TAU (транс вагинальной аспирации. После чего ооциткумулюсные комплексы помещались в среду дюльбекко с добавлением с 5% эстральной сыворотки, 4% р-ра гентамицина и р-ра. гепарина. Поиск и морфологическую оценку осуществляли на стереомикроскопе лабораторного класса, Olympus SZ51 при 200 кратном увеличении. Для экспериментов отбирали ооциты средней величины с мелкозернистой ооплазмой, окруженные компактным многослойным кумулюсом. Для дозревания ооцитов использовали среду 199 (Medium 199, Hepes modification, 25mM.) с добавлением 10% эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота, Na-пирувата, BSA, 1.0 ЕД / мл лютенизирующего гормона, 10 ME/мл, фолликулостимулирующего гормона, 1,0мкг / мл эстрадиола (спиртовой раствор) и 50 мкг / мл гентамицина.
Ооциты помещали в лунки планшетов в среду созревания в объёмом 500 мкл под минеральным маслом ("Sigma", США) и культивировали в течение 20-24 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере 5 % CO2 в воздухе. Для оплодотворения использовали разделённое по полу криоконсервированное семя быков в пайэтах объёмом 0,25 мл из расчёта 1 доза на 30 яйцеклеток. Оттаивание производили при температуре + 37 º С в течении 40 секунд. По той же схеме оттаивалось и обычное семя быков. Получение подвижной фракции сперматозоидов проводили путём центрифугирования в градиенте плотности (р-р перколла) при оборотах ротора центрифуги 300G. Выход подвижных сперматозоидов при центрифугировании в градиенте плотности был больше, чем при использовании метода флотации (Swim Up). Для оплодотворения яйцеклетки перемещались в лунки со средой Fert-TALP объёмом 80 мкл. И инкубировались совместно со сперматозоидами в течении 18-20 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере с содержанием 5 % CO2.
После оплодотворения зиготы отмывали в растворе SOF и механически удаляли клетки кумулюса посредством пепетирования при помощи наконечников для денудации ооцитов диаметром 135 мкм. Очищенные зиготы помещались в среду на основе SOF c добавлением BSA, MEM vitamins, MEM Niaa, MEM iaa в лунки планшетов объёмом 500 мкл, покрытые минеральным маслом ( Sigma ,США) и культивировали при температуре 38,5º С в увлажненной атмосфере под газовой фазой (по 5% CO2 и O 2 и 90 % N2) в течение 7-8 суток. Количество оплодотворённых зигот подсчитывали через 48 и 62 часа после оплодотворения.
Для определения эффективности оплодотворения сексированной спермы использовалось заморожено-оттаянное семя пяти быков. Было оплодотворено 1050 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 944 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 89,93%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 29,42%
Таблица 1 Оплодотворяемость и выход эмбрионов сексированное семя
№п/п |
Бык |
∑ опл. окк |
∑ дроб. |
% от дроб |
Выход бластоцист |
% от опл. |
% от дроб. |
|
1 |
Маузер |
346 |
321 |
93,00% |
94 |
29,28% |
27,16% |
|
2 |
Мосби |
358 |
322 |
90,60% |
96 |
29,81% |
26,81% |
|
3 |
Коди |
121 |
107 |
88,45% |
50 |
46,72,% |
41,32% |
|
4 |
Бигшот |
92 |
88 |
90,88% |
32 |
36,36% |
34,78% |
|
5 |
Инспект |
117 |
106 |
91,55% |
37 |
34,90% |
34,90% |
|
итого |
1050 |
944 |
89,93% |
309 |
32,73% |
29,42% |
||
Во втором случае использовалось обычное заморожено-оттаянное семя от четырёх быков. Было оплодотворено 770 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 708 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 91,94%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 35,58%.
Таблица 2 Оплодотворяемость и выход эмбрионов обычное семя
№п/п |
Вид семени |
∑ опл. окк |
∑ дроб |
% от дроб |
Выход бластоцист |
% от опл. |
% от дроб |
1 |
Обычное |
770 |
708 |
91,94% |
274 |
38,70% |
35,58% |
2 |
сексированное |
1050 |
944 |
89,93% |
309 |
32,73% |
29,42% |
Таким образом сравнивая вышеперечисленные данные, можно сделать вывод, что
оплодотворяющая способность сексированного и традиционного семени не имеет
значительных расхождений.
Таблица 3 Сравнительная характеристика и эффективность использования
сексированного и традиционного семени при производстве эмбрионов in
vitro.
Так разница составила 2,01% в пользу обычного семени.
Выход эмбрионов был больше на 6,16 в пользу обычного семени. Несмотря на то,
что культивирование эмбрионов производилось на одной культуральной системе,
количество полученных эмбрионов in vitro было выше в группе, где использовалось
обычное семя. Мы предполагаем, что это связанно с окрашиванием сперматозоидов
флуоресцентной краской, из-за чего снижается энергетический запас, что и может
обуславливать меньший жизненный потенциал гамет по сравнению с обычным
семенем, как следствие - остановку развития некоторых эмбрионов.
Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что разработанный протокол оплодотворения и культуральная система обладает высоким потенциалом и позволяет получать в массовом количестве разделённые по полу эмбрионы по технологии in vitro. А также может использоваться для получения зигот и предимплантационных эмбрионов КРС in vitro для различных биотехнологических программ.
Статья взята с сайта © DairyNews.ru http://www.dairynews.ru/news/effektivnost-polucheniya-seksirovannykh-embrionov-.html
18.10.2017 0
Директор департамента селекции и семеноводства сельхозкультур «Щёлково Агрохим», д. с.-х. н., член-корреспондент РАН Александр Прянишников стал одним из лауреатов премии им. П. А. Столыпина «Аграрная элита России-2024» в номинации «За развитие селекции и семеноводства в России». Торжественная церемония награждения заслуженных деятелей АПК России прошла 17 апреля 2024 года в рамках заседания Комитета ТПП РФ по развитию агропромышленного комплекса.
В торжественной церемонии награждения лауреатов прининяли участие известные аграрному сообществу люди
Столыпинская премия – одна из старейших общественных наград страны, почётно вручается выдающимся представителям аграрного сектора за выдающиеся достижения в развитии сельского хозяйства и реализацию инновационных проектов. В этом году церемония награждения прошла в 27-й раз и продолжает поддерживать и поощрять успешные и перспективные инициативы в сельском хозяйстве РФ.
Национальной премии имени П. А. Столыпина удостоены те, чьи имена известны всему аграрному сообществу. Среди лауреатов – видные учёные, общественные деятели, руководители регионов, крупных промышленных предприятий, которые являются не только коллегами, но и добрыми друзьями «Щёлково Агрохим».
Так, генеральный директор АО «АгроГард» Павел Царев награждён «За вклад в развитие АПК России». Руководитель аппарата Картофельного Союза Татьяна Губина получила награду в номинации «За вклад в развитие картофелеводства в России». Директор ФГБНУ «Федеральный научный центр риса» Сергей Гаркуша – «За вклад в развитие рисоводства».
Александр Иванович – создатель знаменитых высокопродуктивных сортов Орловского биотипа
Напомним, что Александр Прянишников – автор более 20 сортов озимой пшеницы, 5 сортов сои и 3 гибридов подсолнечника. Селекционные достижения пользуются широким спросом в сельскохозяйственном производстве. Александр Иванович – создатель высокопродуктивных сортов Орловского биотипа, которые впервые в России реализовали потенциал урожайности озимой пшеницы на уровне 165 ц/га и выше, а в производстве два года подряд сорт Ермоловка входит в «Книгу рекордов России» с урожайностью 122,6 ц/га (2023 г.). Также учёный курирует селекционные программы по селекции сои, гибридного подсолнечника и гороха, им сформированы основные экологические векторы селекционной работы, которые через систему эколого-географических испытаний реализованы в различных регионах РФ. А благодаря успешному частно-государственному партнёрству в стране реализуются масштабные проекты.
После церемонии награждения состоялся приём в честь лауреатов премии, организованный Международным сельскохозяйственным журналом, который в этом году отмечает 67-й год с момента образования.
Коллектив «Щёлково Агрохим» искренне поздравляет Александра Ивановича с такой замечательной наградой, являющейся ещё одним признанием профессиональных заслуг.