18.10.2017: Как это осуществляется в "Бетагран - Липецк".
 |
Дмитрий Машталер
старший эмбриолог ООО "Бетагран- Липецк"
В течении последнего времени в России уделяется существенное внимание вопросам в области воспроизводства стада и повышения уровня племенных качеств животных, так как это является краеугольным камнем в отечественном животноводстве. Однако успешное решение данных вопросов невозможно без использования современных методов и технологий, которые уже давно нашли свое применение в странах Запада.
Получение эмбрионов крупного рогатого скота методом in vitro - современный и прогрессивный биотехнологический метод, позволяющий значительно ускорить процесс воспроизводства высокопродуктивных животных. Данный метод состоит из нескольких этапов: извлечение ооцитов из антральных фолликулов яичника (OPU), созревания ооцитов (IVM - in vitro maturation); оплодотворения (IVF - in vitro fertilization) и эмбриональной культуры (IVC - in vitro culture). Важным аспектом данной технологии является то, что получать яйцеклетки от животных доноров можно как прижизненно, используя метод трансвагинальной аспирации, так и от убойного материала (яичники коров с мясокомбината). Получение разделённых по полу эмбрионов - востребованный и перспективный метод, который заключается в оплодотворении яйцеклеток сексированной спермой быков. Оплодотворение яйцеклеток разделённой по полу спермой в отличие от обычной даёт возможность получать особей желательного пола с вероятностью до 93 %. Помимо возможностей в области селекции данный метод имеет и ряд экономических преимуществ, а именно: при пересадке эмбрионов, не разделённых по полу, частота рождения бычков составляет до 55%. Что имеет немаловажное значение в молочном скотоводстве, где есть большая потребность в ремонтных тёлочках с высокой молочной продуктивностью.
Исходя из этого перед коллективом лаборатории ООО «Бетагран- Липецк» была поставлена задача направленная на создание оптимального протокола оплодотворения и культивирования доимплантированных эмбрионов in vitro. Для этого ооциткумулюсные комплексы получали прижизненно из антарльных фолликулов диаметром 2-6 мм от коров доноров методом TAU (транс вагинальной аспирации. После чего ооциткумулюсные комплексы помещались в среду дюльбекко с добавлением с 5% эстральной сыворотки, 4% р-ра гентамицина и р-ра. гепарина. Поиск и морфологическую оценку осуществляли на стереомикроскопе лабораторного класса, Olympus SZ51 при 200 кратном увеличении. Для экспериментов отбирали ооциты средней величины с мелкозернистой ооплазмой, окруженные компактным многослойным кумулюсом. Для дозревания ооцитов использовали среду 199 (Medium 199, Hepes modification, 25mM.) с добавлением 10% эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота, Na-пирувата, BSA, 1.0 ЕД / мл лютенизирующего гормона, 10 ME/мл, фолликулостимулирующего гормона, 1,0мкг / мл эстрадиола (спиртовой раствор) и 50 мкг / мл гентамицина.
Ооциты помещали в лунки планшетов в среду созревания в объёмом 500 мкл под минеральным маслом ("Sigma", США) и культивировали в течение 20-24 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере 5 % CO2 в воздухе. Для оплодотворения использовали разделённое по полу криоконсервированное семя быков в пайэтах объёмом 0,25 мл из расчёта 1 доза на 30 яйцеклеток. Оттаивание производили при температуре + 37 º С в течении 40 секунд. По той же схеме оттаивалось и обычное семя быков. Получение подвижной фракции сперматозоидов проводили путём центрифугирования в градиенте плотности (р-р перколла) при оборотах ротора центрифуги 300G. Выход подвижных сперматозоидов при центрифугировании в градиенте плотности был больше, чем при использовании метода флотации (Swim Up). Для оплодотворения яйцеклетки перемещались в лунки со средой Fert-TALP объёмом 80 мкл. И инкубировались совместно со сперматозоидами в течении 18-20 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере с содержанием 5 % CO2.
После оплодотворения зиготы отмывали в растворе SOF и механически удаляли клетки кумулюса посредством пепетирования при помощи наконечников для денудации ооцитов диаметром 135 мкм. Очищенные зиготы помещались в среду на основе SOF c добавлением BSA, MEM vitamins, MEM Niaa, MEM iaa в лунки планшетов объёмом 500 мкл, покрытые минеральным маслом ( Sigma ,США) и культивировали при температуре 38,5º С в увлажненной атмосфере под газовой фазой (по 5% CO2 и O 2 и 90 % N2) в течение 7-8 суток. Количество оплодотворённых зигот подсчитывали через 48 и 62 часа после оплодотворения.
Для определения эффективности оплодотворения сексированной спермы использовалось заморожено-оттаянное семя пяти быков. Было оплодотворено 1050 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 944 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 89,93%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 29,42%
Таблица 1 Оплодотворяемость и выход эмбрионов сексированное семя
|
№п/п |
Бык |
∑ опл. окк |
∑ дроб. |
% от дроб |
Выход бластоцист |
% от опл. |
% от дроб. |
|
|
1 |
Маузер |
346 |
321 |
93,00% |
94 |
29,28% |
27,16% |
|
|
2 |
Мосби |
358 |
322 |
90,60% |
96 |
29,81% |
26,81% |
|
|
3 |
Коди |
121 |
107 |
88,45% |
50 |
46,72,% |
41,32% |
|
|
4 |
Бигшот |
92 |
88 |
90,88% |
32 |
36,36% |
34,78% |
|
|
5 |
Инспект |
117 |
106 |
91,55% |
37 |
34,90% |
34,90% |
|
|
итого |
1050 |
944 |
89,93% |
309 |
32,73% |
29,42% |
||
Во втором случае использовалось обычное заморожено-оттаянное семя от четырёх быков. Было оплодотворено 770 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 708 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 91,94%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 35,58%.
Таблица 2 Оплодотворяемость и выход эмбрионов обычное семя
|
№п/п |
Вид семени |
∑ опл. окк |
∑ дроб |
% от дроб |
Выход бластоцист |
% от опл. |
% от дроб |
|
1 |
Обычное |
770 |
708 |
91,94% |
274 |
38,70% |
35,58% |
|
2 |
сексированное |
1050 |
944 |
89,93% |
309 |
32,73% |
29,42% |
Таким образом сравнивая вышеперечисленные данные, можно сделать вывод, что
оплодотворяющая способность сексированного и традиционного семени не имеет
значительных расхождений.
Таблица 3 Сравнительная характеристика и эффективность использования
сексированного и традиционного семени при производстве эмбрионов in
vitro.
Так разница составила 2,01% в пользу обычного семени.
Выход эмбрионов был больше на 6,16 в пользу обычного семени. Несмотря на то,
что культивирование эмбрионов производилось на одной культуральной системе,
количество полученных эмбрионов in vitro было выше в группе, где использовалось
обычное семя. Мы предполагаем, что это связанно с окрашиванием сперматозоидов
флуоресцентной краской, из-за чего снижается энергетический запас, что и может
обуславливать меньший жизненный потенциал гамет по сравнению с обычным
семенем, как следствие - остановку развития некоторых эмбрионов.
Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что разработанный протокол оплодотворения и культуральная система обладает высоким потенциалом и позволяет получать в массовом количестве разделённые по полу эмбрионы по технологии in vitro. А также может использоваться для получения зигот и предимплантационных эмбрионов КРС in vitro для различных биотехнологических программ.
Статья взята с сайта © DairyNews.ru http://www.dairynews.ru/news/effektivnost-polucheniya-seksirovannykh-embrionov-.html
18.10.2017 0
Учёные исследовали перспективные баковые смеси протравителей и биостимулятора БИОСТИМ СТАРТ для обработки семян ярового ячменя.
На протяжении 2022-2023 гг. сотрудники ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» (ВНИИЗР) изучали биологическую эффективность различных протравителей семян и их комбинаций с биостимулятором БИОСТИМ СТАРТ при обработке семян ярового ячменя.
Условия опыта
В исследованиях, которые проводились в условиях лесостепи Черноземья, участвовали пять инсекто-фунгицидных протравителей отечественного и зарубежного производства, включая препараты АО «Щёлково Агрохим»:
- инсекто-фунгицидный протравитель ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ;
- баковая смесь фунгицидного и инсектицидного протравителей ГЕРАКЛИОН, КС и БОМБАРДА, КС.
Кроме того, в ряде вариантов опыта использовали аминокислотный биостимулятор БИОСТИМ СТАРТ производства «Щёлково Агрохим».
Опыт состоял из 12 вариантов обработки семян. За эталон был принят четырёхкомпонентный инсекто-фунгицидный протравитель на основе имидаклоприда, тиабендазола, тебуконазола и имазалила.
Исследования проводили на сорте ярового пивоваренного ячменя Эксплоер. Протравливание семян осуществляли на малогабаритном протравливателе Hege 11 перед посевом согласно регламентам применения испытываемых препаратов. Посев проводили селекционной сеялкой ССН-7. Уборку опытных делянок вели селекционным комбайном SR 2010 Terrion Sampo.
В лабораторных условиях была изучена эффективность препаратов против плесневения семян. Для определения инфекции на семенах применяли рулонный метод анализа.
В полевых опытах размер делянок составил 30 м², повторность – четырёхкратная, размещение делянок – рандомизированное.
В среднем за годы исследований в контроле отмечали:
развитие плесневения семян – на уровне 30,5%;- развитие корневых гнилей в фазу кущения – 9,0%, в фазу колошения – 18,0%;
- поражённость растений пыльной головнёй – 2,4%;
- повреждение растений ярового ячменя хлебной полосатой блошкой – 2,1 балла;
- повреждённость стеблей личинками злаковых мух – 25,7%.
Фунгицидная активность
Плесневение семян
Фунгицидная активность протравителей против плесневения семян в среднем за период исследований составила 72,8-89,1%. Наиболее высокие показатели эффективности отмечены на вариантах:
- ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ – 89,1% (+16,3% относительно эталона);
- ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС – 87,2% (+14,4%).
Добавление в баковую смесь к протравителям биостимулятора БИОСТИМ СТАРТ способствовало увеличению эффективности ещё на 3,6-9% (табл. 1).
В итоге самый высокий показатель фунгицидной активности из испытуемых вариантов продемонстрировали баковые смеси:
- ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС + БИОСТИМ СТАРТ – 96,2% (+23,4%);
- ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ + БИОСТИМ СТАРТ – 92,7% (+19,9%).
Корневые гнили
Учёт развития корневых гнилей проводили два раза: в фазу кущения и колошения.
Фунгицидная активность протравителей против корневых гнилей в фазу кущения составила по вариантам 76,1-90,1% при развитии в контроле 9%. Эффективность эталона оказалась на уровне 80,9%. Выше значений эталона она отмечена лишь в вариантах «Щёлково Агрохим»:
- ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ – 87,6% (+7,6%);
- ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС – 90,1% (+9,2%).
Добавление биостимулятора БИОСТИМ СТАРТ не оказывало влияния в этой фазе на эффективность большинства протравителей, в том числе препаратов «Щёлково Агрохим».
При учёте корневых гнилей в фазу колошения эффективность препаратов снизилась до уровня 65,6-77,9%, а развитие в контроле увеличилось до 18%. Выше эталона отмечена эффективность также только на двух вариантах:
- ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС + БИОСТИМ СТАРТ – 77,9% (+10,4%);
- ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ + БИОСТИМ СТАРТ – 72% (+4,5%).
Здоровые растения – залог высоких и качественных урожаев
Рис. - Фунгицидная активность протравителей в баковой смеси с Биостим Старт против корневых гнилей ярового ячменя
Примечание: П1, П2, П3, П4 – варианты протравителей; БС – БИОСТИМ СТАРТ
Пыльная головня
Против пыльной головни 100%-ную эффективность продемонстрировали все протравители, содержащие тебуконазол. И только в одном варианте, где фунгицидная часть была представлена дифеноконазолом и флудиоксонилом, эффективность составила 79,2%.
Развитие головни в контроле – 2,4%. БИОСТИМ СТАРТ не оказывал влияния на эффективность препаратов против пыльной головни.
Табл. 1 – Эффективность пестицидов и их баковых смесей с биостимулятором при обработке семян ярового ячменя (в среднем за 2022-2023 гг.)
| № п/п | Вариант | Норма применения, л/т | Биологическая эффективность, % | Урожайность, ц/га | Рентабельность, % | |||||
| Плесневение семян** | Корневые гнили | Пыльная головня | Снижение повреждённости растений | |||||||
| Кущение | Колошение | Хлебная полосатая блошка | Личинки злаковых мух | |||||||
| Контроль* (без обработки) | – | 30,5 | 9,0 | 18,0 | 2,4 | 2,1 | 25,7 | 53,2 | – | |
| 1 |
Протравитель 1 (имидаклоприд [300 г/л] + тиабендазол [30 г/л] + тебуконазол [30 г/л] + имазалил [20 г/л] – эталон) |
0,8 | 72,8 | 80,9 | 67,5 | 100 | 83,8 | 79,0 | 60,9 | 98 |
| 2 | Протравитель 1 + БИОСТИМ СТАРТ | 0,8 + 0,8 | 79,8 | 81,6 | 75,1 | 100 | 83,8 | 79,8 | 64,8 | 131 |
| 3 |
Протравитель 2 (тиаметоксам [175 г/л] + седаксан [25 г/л] + флудиоксонил [25 г/л] + тебуконазол [10 г/л]) |
1,75 | 81,7 | 82,9 | 69,0 | 100 | 81,9 | 79,4 | 61,4 | 50 |
| 4 | Протравитель 2 + БИОСТИМ СТАРТ | 1,75 + 0,8 | 81,7 | 83,2 | 77,1 | 100 | 81,9 | 79,4 | 64,5 | 78 |
| 5 |
Протравитель 3 (тиаметоксам [262,5 г/л] + дифеноконазол [25 г/л] + флудиоксонил [25 г/л]) |
1,2 | 72,8 | 76,1 | 67,5 | 79,2 | 82,9 | 81,3 | 59,4 | 77 |
| 6 | Протравитель 3 + БИОСТИМ СТАРТ | 1,2 + 0,8 | 72,8 | 81,1 | 68,4 | 79,2 | 84,3 | 81,7 | 62,4 | 106 |
| 7 | Протравитель 4 (имидаклоприд [333 г/л] + дифеноконазол [67 г/л] + тебуконазол [17 г/л]) | 1,3 | 78,2 | 76,3 | 65,6 | 100 | 84,3 | 81,3 | 60,8 | 94 |
| 8 | Протравитель 4 + БИОСТИМ СТАРТ | 1,3 + 0,8 | 78,7 | 80,7 | 70,7 | 100 | 84,8 | 80,9 | 63,8 | 118 |
| 9 | ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ | 1,2 | 89,1 | 87,6 | 72,0 | 100 | 85,7 | 82,5 | 61,5 | 94 |
| 10 | ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ + БИОСТИМ СТАРТ | 1,2 + 0,8 | 92,7 | 88,3 | 77,9 | 100 | 85,7 | 83,3 | 65,0 | 121 |
| 11 | БОМБАРДА, КС + ГЕРАКЛИОН, КС | 1,0 + 1,0 | 87,2 | 90,1 | 77,9 | 100 | 95,2 | 90,3 | 62,3 | 101 |
| 12 | БОМБАРДА, КС + ГЕРАКЛИОН, КС + БИОСТИМ СТАРТ | 1,0 +1,0 + 0,8 | 96,2 | 90,1 | 77,9 | 100 | 96,2 | 91,1 | 66,0 | 121 |
контроль* – абсолютные показатели развития болезней – в %; поражённость растений пыльной головнёй – в %; повреждённость стеблей личинками злаковых мух – в %; повреждённость растений хлебной полосатой блошкой – в баллах;
** – данные лабораторного опыта
Инсектицидная активность
Хлебная полосатая блошка и личинки злаковых мух
В среднем за период исследований все готовые инсекто-фунгицидные протравители снижали повреждённость растений хлебной блошкой на 81,9-85,7%, повреждённость стеблей личинками злаковых мух – на 79-82,5%, что было на уровне эталона.
Эффективность баковой смеси ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС против этих вредителей превысила эталон более чем на 11% и составила 95,2 и 90,3% соответственно. Это говорит о более высоком уровне инсектицидной защиты протравителя БОМБАРДА, КС (рис. 2). Стимулятор БИОСТИМ СТАРТ не оказывал влияния на эффективность препаратов против вредителей.
Рис. 2 - Влияние инсекто-фунгицидных протравителей на снижение поврежденности растений ячменя хлебной полосатой блошкой и личинками злаковых мух
Урожайность ярового ячменя
Средняя урожайность в контроле за два года исследований составила 53,2 ц/га. Применение только протравителей сохраняло от 6 до 9 ц/га зерна, что составило 11-17% по отношению к контролю. Добавление биостимулятора к протравителям повышало урожайность ещё на 3-3,7 ц/га. Соответственно, самые высокие показатели урожайности отмечены в вариантах с БИОСТИМ СТАРТ (рис. 3).
Наибольшую урожайность из всех испытуемых вариантов продемонстрировали баковые смеси:
- ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС + БИОСТИМ СТАРТ – 66,0 ц/га;
- ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ + БИОСТИМ СТАРТ – 65,0 ц/га.
Прибавка урожая от применения этих препаратов относительно контроля составила 22-24%.
Рис. 3 – Урожайность ярового ячменя с протравителями
Рентабельность применения
Расчёт экономической эффективности в конечном итоге определяет целесообразность применения того или иного препарата, комплекса препаратов или проведения защитных мероприятий в целом. Протравливание семян зерновых культур, как приём защиты растений, являющийся базовым в комплексной защите культур, как правило, показывает высокую рентабельность его применения. Это связано со сравнительно низкими затратами на препараты в расчёте на 1 га и их высокой окупаемостью.
В данных исследованиях все варианты протравителей и их баковых смесей оказались рентабельными. А самые высокие показатели – выше 100% – отмечены на вариантах с биостимулятором БИОСТИМ СТАРТ.
Максимальные показатели рентабельности отмечены на вариантах с биостимулятором БИОСТИМ СТАРТ
Выводы
Согласно двухлетним исследованиям, наиболее эффективную защиту посевов ярового ячменя от комплекса семенной инфекции и вредителей всходов обеспечили инсекто-фунгицидный протравитель ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ и баковая смесь ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС как при индивидуальном применении, так и с биостимулятором БИОСТИМ СТАРТ. А наиболее рентабельным оказалось применение названных пестицидов в смеси с БИОСТИМ СТАРТ.