RUS
ENG
RUS
ENG
Мобильное
приложение
Обратная
связь
+7 (495) 745-05-51

Эффективность получения сексированных эмбрионов КРС методом in vitro

18.10.2017: Как это осуществляется в "Бетагран - Липецк".


Дмитрий Машталер
старший эмбриолог ООО "Бетагран- Липецк"

В течении последнего времени в России уделяется существенное внимание вопросам в области воспроизводства стада и повышения уровня племенных качеств животных, так как это является краеугольным камнем в отечественном животноводстве. Однако успешное решение данных вопросов невозможно без использования современных методов и технологий, которые уже давно нашли свое применение в странах Запада.

Получение эмбрионов крупного рогатого скота методом in vitro - современный и прогрессивный биотехнологический метод, позволяющий значительно ускорить процесс воспроизводства высокопродуктивных животных. Данный метод состоит из нескольких этапов: извлечение ооцитов из антральных фолликулов яичника (OPU), созревания ооцитов (IVM - in vitro maturation); оплодотворения (IVF - in vitro fertilization) и эмбриональной культуры (IVC - in vitro culture). Важным аспектом данной технологии является то, что получать яйцеклетки от животных доноров можно как прижизненно, используя метод трансвагинальной аспирации, так и от убойного материала (яичники коров с мясокомбината). Получение разделённых по полу эмбрионов - востребованный и перспективный метод, который заключается в оплодотворении яйцеклеток сексированной спермой быков. Оплодотворение яйцеклеток разделённой по полу спермой в отличие от обычной даёт возможность получать особей желательного пола с вероятностью до 93 %. Помимо возможностей в области селекции данный метод имеет и ряд экономических преимуществ, а именно: при пересадке эмбрионов, не разделённых по полу, частота рождения бычков составляет до 55%. Что имеет немаловажное значение в молочном скотоводстве, где есть большая потребность в ремонтных тёлочках с высокой молочной продуктивностью.

Исходя из этого перед коллективом лаборатории ООО «Бетагран- Липецк» была поставлена задача направленная на создание оптимального протокола оплодотворения и культивирования доимплантированных эмбрионов in vitro. Для этого ооциткумулюсные комплексы получали прижизненно из антарльных фолликулов диаметром 2-6 мм от коров доноров методом TAU (транс вагинальной аспирации. После чего ооциткумулюсные комплексы помещались в среду дюльбекко с добавлением с 5% эстральной сыворотки, 4% р-ра гентамицина и р-ра. гепарина. Поиск и морфологическую оценку осуществляли на стереомикроскопе лабораторного класса, Olympus SZ51 при 200 кратном увеличении. Для экспериментов отбирали ооциты средней величины с мелкозернистой ооплазмой, окруженные компактным многослойным кумулюсом. Для дозревания ооцитов использовали среду 199 (Medium 199, Hepes modification, 25mM.) с добавлением 10% эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота, Na-пирувата, BSA, 1.0 ЕД / мл лютенизирующего гормона, 10 ME/мл, фолликулостимулирующего гормона, 1,0мкг / мл эстрадиола (спиртовой раствор) и 50 мкг / мл гентамицина.

Ооциты помещали в лунки планшетов в среду созревания в объёмом 500 мкл под минеральным маслом ("Sigma", США) и культивировали в течение 20-24 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере 5 % CO2 в воздухе. Для оплодотворения использовали разделённое по полу криоконсервированное семя быков в пайэтах объёмом 0,25 мл из расчёта 1 доза на 30 яйцеклеток. Оттаивание производили при температуре + 37 º С в течении 40 секунд. По той же схеме оттаивалось и обычное семя быков. Получение подвижной фракции сперматозоидов проводили путём центрифугирования в градиенте плотности (р-р перколла) при оборотах ротора центрифуги 300G. Выход подвижных сперматозоидов при центрифугировании в градиенте плотности был больше, чем при использовании метода флотации (Swim Up). Для оплодотворения яйцеклетки перемещались в лунки со средой Fert-TALP объёмом 80 мкл. И инкубировались совместно со сперматозоидами в течении 18-20 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере с содержанием 5 % CO2.

После оплодотворения зиготы отмывали в растворе SOF и механически удаляли клетки кумулюса посредством пепетирования при помощи наконечников для денудации ооцитов диаметром 135 мкм. Очищенные зиготы помещались в среду на основе SOF c добавлением BSA, MEM vitamins, MEM Niaa, MEM iaa в лунки планшетов объёмом 500 мкл, покрытые минеральным маслом ( Sigma ,США) и культивировали при температуре 38,5º С в увлажненной атмосфере под газовой фазой (по 5% CO2 и O 2 и 90 % N2) в течение 7-8 суток. Количество оплодотворённых зигот подсчитывали через 48 и 62 часа после оплодотворения.

Для определения эффективности оплодотворения сексированной спермы использовалось заморожено-оттаянное семя пяти быков. Было оплодотворено 1050 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 944 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 89,93%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 29,42%

Таблица 1 Оплодотворяемость и выход эмбрионов сексированное семя

№п/п

Бык

∑ опл. окк

∑ дроб.

% от дроб

Выход бластоцист

% от опл.

% от дроб.

1

Маузер

346

321

93,00%

94

29,28%

27,16%

2

Мосби

358

322

90,60%

96

29,81%

26,81%

3

Коди

121

107

88,45%

50

46,72,%

41,32%

4

Бигшот

92

88

90,88%

32

36,36%

34,78%

5

Инспект

117

106

91,55%

37

34,90%

34,90%

итого

1050

944

89,93%

309

32,73%

29,42%

Во втором случае использовалось обычное заморожено-оттаянное семя от четырёх быков. Было оплодотворено 770 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 708 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 91,94%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 35,58%.

Таблица 2 Оплодотворяемость и выход эмбрионов обычное семя

№п/п

Вид семени

∑ опл. окк

∑ дроб

% от дроб

Выход бластоцист

% от опл.

% от дроб

1

Обычное

770

708

91,94%

274

38,70%

35,58%

2

сексированное

1050

944

89,93%

309

32,73%

29,42%


Таким образом сравнивая вышеперечисленные данные, можно сделать вывод, что оплодотворяющая способность сексированного и традиционного семени не имеет значительных расхождений.


Таблица 3 Сравнительная характеристика и эффективность использования сексированного и традиционного семени при производстве эмбрионов in vitro.


Так разница составила 2,01% в пользу обычного семени. Выход эмбрионов был больше на 6,16 в пользу обычного семени. Несмотря на то, что культивирование эмбрионов производилось на одной культуральной системе, количество полученных эмбрионов in vitro было выше в группе, где использовалось обычное семя. Мы предполагаем, что это связанно с окрашиванием сперматозоидов флуоресцентной краской, из-за чего снижается энергетический запас, что и может обуславливать меньший жизненный потенциал гамет по сравнению с обычным семенем, как следствие - остановку развития некоторых эмбрионов.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что разработанный протокол оплодотворения и культуральная система обладает высоким потенциалом и позволяет получать в массовом количестве разделённые по полу эмбрионы по технологии in vitro. А также может использоваться для получения зигот и предимплантационных эмбрионов КРС in vitro для различных биотехнологических программ.

Статья взята с сайта © DairyNews.ru http://www.dairynews.ru/news/effektivnost-polucheniya-seksirovannykh-embrionov-.html

18.10.2017 0
30.10.2024
Рецепт высоких результатов от «Щёлково Агрохим»: эффективный протравитель плюс биостимулятор

Учёные исследовали перспективные баковые смеси протравителей и биостимулятора БИОСТИМ СТАРТ для обработки семян ярового ячменя.

На протяжении 2022-2023 гг. сотрудники ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» (ВНИИЗР) изучали биологическую эффективность различных протравителей семян и их комбинаций с биостимулятором БИОСТИМ СТАРТ при обработке семян ярового ячменя.

shutterstock_2346796817 (1).jpg

Условия опыта

В исследованиях, которые проводились в условиях лесостепи Черноземья, участвовали пять инсекто-фунгицидных протравителей отечественного и зарубежного производства, включая препараты АО «Щёлково Агрохим»:

Кроме того, в ряде вариантов опыта использовали аминокислотный биостимулятор БИОСТИМ СТАРТ производства «Щёлково Агрохим».

Опыт состоял из 12 вариантов обработки семян. За эталон был принят четырёхкомпонентный инсекто-фунгицидный протравитель на основе имидаклоприда, тиабендазола, тебуконазола и имазалила.

Исследования проводили на сорте ярового пивоваренного ячменя Эксплоер. Протравливание семян осуществляли на малогабаритном протравливателе Hege 11 перед посевом согласно регламентам применения испытываемых препаратов. Посев проводили селекционной сеялкой ССН-7. Уборку опытных делянок вели селекционным комбайном SR 2010 Terrion Sampo.

В лабораторных условиях была изучена эффективность препаратов против плесневения семян. Для определения инфекции на семенах применяли рулонный метод анализа.

В полевых опытах размер делянок составил 30 м², повторность – четырёхкратная, размещение делянок – рандомизированное.

В среднем за годы исследований в контроле отмечали:            

развитие плесневения семян – на уровне 30,5%;
  • развитие корневых гнилей в фазу кущения – 9,0%, в фазу колошения – 18,0%;
  • поражённость растений пыльной головнёй – 2,4%;
  • повреждение растений ярового ячменя хлебной полосатой блошкой – 2,1 балла;
  • повреждённость стеблей личинками злаковых мух – 25,7%.

Фунгицидная активность

Плесневение семян

Фунгицидная активность протравителей против плесневения семян в среднем за период исследований составила 72,8-89,1%. Наиболее высокие показатели эффективности отмечены на вариантах:  

Добавление в баковую смесь к протравителям биостимулятора БИОСТИМ СТАРТ способствовало увеличению эффективности ещё на 3,6-9% (табл. 1).

В итоге самый высокий показатель фунгицидной активности из испытуемых вариантов продемонстрировали баковые смеси:

  • ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС + БИОСТИМ СТАРТ96,2% (+23,4%);
  • ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ + БИОСТИМ СТАРТ – 92,7% (+19,9%).

Корневые гнили

Учёт развития корневых гнилей проводили два раза: в фазу кущения и колошения.

Фунгицидная активность протравителей против корневых гнилей в фазу кущения составила по вариантам 76,1-90,1% при развитии в контроле 9%. Эффективность эталона оказалась на уровне 80,9%. Выше значений эталона она отмечена лишь в вариантах «Щёлково Агрохим»:

  • ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ87,6% (+7,6%);
  • ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС90,1% (+9,2%).

Добавление биостимулятора БИОСТИМ СТАРТ не оказывало влияния в этой фазе на эффективность большинства протравителей, в том числе препаратов «Щёлково Агрохим».

При учёте корневых гнилей в фазу колошения эффективность препаратов снизилась до уровня 65,6-77,9%, а развитие в контроле увеличилось до 18%. Выше эталона отмечена эффективность также только на двух вариантах:

  • ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС + БИОСТИМ СТАРТ77,9% (+10,4%);
  • ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ + БИОСТИМ СТАРТ72% (+4,5%).
Остальные варианты были на уровне эталона – 67,5%. В этот раз отмечено, что добавление к протравителям биостимулятора БИОСТИМ СТАРТ повышало эффективность большинства препаратов ещё на 5-8%.

shutterstock_2441666447.jpg
Здоровые растения – залог высоких и качественных урожаев

Рис. - Фунгицидная активность протравителей в баковой смеси с Биостим Старт против корневых гнилей ярового ячменя

Диаграмма1.PNG
Примечание: П1, П2, П3, П4 – варианты протравителей; БС – БИОСТИМ СТАРТ

Пыльная головня

Против пыльной головни 100%-ную эффективность продемонстрировали все протравители, содержащие тебуконазол. И только в одном варианте, где фунгицидная часть была представлена дифеноконазолом и флудиоксонилом, эффективность составила 79,2%.

Развитие головни в контроле – 2,4%. БИОСТИМ СТАРТ не оказывал влияния на эффективность препаратов против пыльной головни.

Табл. 1 – Эффективность пестицидов и их баковых смесей с биостимулятором при обработке семян ярового ячменя (в среднем за 2022-2023 гг.)

№ п/п Вариант Норма применения, л/т Биологическая эффективность, % Урожайность, ц/га Рентабельность, %
Плесневение семян** Корневые гнили Пыльная головня Снижение повреждённости растений
Кущение Колошение Хлебная полосатая блошка Личинки злаковых мух
  Контроль* (без обработки) 30,5 9,0 18,0 2,4 2,1 25,7 53,2
1 Протравитель 1
(имидаклоприд [300 г/л] + тиабендазол [30 г/л] + тебуконазол [30 г/л] + имазалил [20 г/л] – эталон)
0,8 72,8 80,9 67,5 100 83,8 79,0 60,9 98
2 Протравитель 1 + БИОСТИМ СТАРТ 0,8 + 0,8 79,8 81,6 75,1 100 83,8 79,8 64,8 131
3 Протравитель 2
(тиаметоксам [175 г/л] + седаксан [25 г/л] + флудиоксонил [25 г/л] + тебуконазол [10 г/л])
1,75 81,7 82,9 69,0 100 81,9 79,4 61,4 50
4 Протравитель 2 + БИОСТИМ СТАРТ 1,75 + 0,8 81,7 83,2 77,1 100 81,9 79,4 64,5 78
5 Протравитель 3
(тиаметоксам [262,5 г/л] + дифеноконазол [25 г/л] + флудиоксонил [25 г/л])
1,2 72,8 76,1 67,5 79,2 82,9 81,3 59,4 77
6 Протравитель 3 + БИОСТИМ СТАРТ 1,2 + 0,8 72,8 81,1 68,4 79,2 84,3 81,7 62,4 106
7 Протравитель 4 (имидаклоприд [333 г/л] + дифеноконазол [67 г/л] + тебуконазол [17 г/л]) 1,3 78,2 76,3 65,6 100 84,3 81,3 60,8 94
8 Протравитель 4 + БИОСТИМ СТАРТ 1,3 + 0,8 78,7 80,7 70,7 100 84,8 80,9 63,8 118
9 ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ 1,2 89,1 87,6 72,0 100 85,7 82,5 61,5 94
10 ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ + БИОСТИМ СТАРТ 1,2 + 0,8 92,7 88,3 77,9 100 85,7 83,3 65,0 121
11 БОМБАРДА, КС + ГЕРАКЛИОН, КС 1,0 + 1,0 87,2 90,1 77,9 100 95,2 90,3 62,3 101
12 БОМБАРДА, КС + ГЕРАКЛИОН, КС + БИОСТИМ СТАРТ 1,0 +1,0 + 0,8 96,2 90,1 77,9 100 96,2 91,1 66,0 121
Примечание:

контроль* – абсолютные показатели развития болезней – в %; поражённость растений пыльной головнёй – в %; повреждённость стеблей личинками злаковых мух – в %; повреждённость растений хлебной полосатой блошкой – в баллах;

** – данные лабораторного опыта 



Инсектицидная активность

Хлебная полосатая блошка и личинки злаковых мух

В среднем за период исследований все готовые инсекто-фунгицидные протравители снижали повреждённость растений хлебной блошкой на 81,9-85,7%, повреждённость стеблей личинками злаковых мух – на 79-82,5%, что было на уровне эталона.

Эффективность баковой смеси ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС против этих вредителей превысила эталон более чем на 11% и составила 95,2 и 90,3% соответственно. Это говорит о более высоком уровне инсектицидной защиты протравителя БОМБАРДА, КС (рис. 2). Стимулятор БИОСТИМ СТАРТ не оказывал влияния на эффективность препаратов против вредителей.

Диаграмма 2.PNG 
Рис. 2 - Влияние инсекто-фунгицидных протравителей на снижение поврежденности растений ячменя хлебной полосатой блошкой и личинками злаковых мух



Урожайность ярового ячменя

Средняя урожайность в контроле за два года исследований составила 53,2 ц/га. Применение только протравителей сохраняло от 6 до 9 ц/га зерна, что составило 11-17% по отношению к контролю. Добавление биостимулятора к протравителям повышало урожайность ещё на 3-3,7 ц/га. Соответственно, самые высокие показатели урожайности отмечены в вариантах с БИОСТИМ СТАРТ (рис. 3).

Наибольшую урожайность из всех испытуемых вариантов продемонстрировали баковые смеси:

  • ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС + БИОСТИМ СТАРТ66,0 ц/га;
  • ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ + БИОСТИМ СТАРТ65,0 ц/га.

Прибавка урожая от применения этих препаратов относительно контроля составила 22-24%.

Диаграмма 3.PNG
Рис. 3 – Урожайность ярового ячменя с протравителями

Рентабельность применения

Расчёт экономической эффективности в конечном итоге определяет целесообразность применения того или иного препарата, комплекса препаратов или проведения защитных мероприятий в целом. Протравливание семян зерновых культур, как приём защиты растений, являющийся базовым в комплексной защите культур, как правило, показывает высокую рентабельность его применения. Это связано со сравнительно низкими затратами на препараты в расчёте на 1 га и их высокой окупаемостью.

В данных исследованиях все варианты протравителей и их баковых смесей оказались рентабельными. А самые высокие показатели – выше 100% – отмечены на вариантах с биостимулятором БИОСТИМ СТАРТ.

shutterstock_2398373225 (1).jpg
Максимальные показатели рентабельности отмечены на вариантах с биостимулятором БИОСТИМ СТАРТ

Выводы

Согласно двухлетним исследованиям, наиболее эффективную защиту посевов ярового ячменя от комплекса семенной инфекции и вредителей всходов обеспечили инсекто-фунгицидный протравитель ПОЛАРИС КВАТРО, СМЭ и баковая смесь ГЕРАКЛИОН, КС + БОМБАРДА, КС как при индивидуальном применении, так и с биостимулятором БИОСТИМ СТАРТ. А наиболее рентабельным оказалось применение названных пестицидов в смеси с БИОСТИМ СТАРТ.

37
Показать ещё